人工纳米红细胞:提高化疗免疫疗效的药物递送载体

Artificial Nanoscale Erythrocytes from Clinically Relevant Compounds for Enhancing Cancer Immunotherapy

Wenquan Ou, Kang Sik Nam, Dae Hoon Park, Jungho Hwang*, Sae Kwang Ku, Chul Soon Yong, Jong Oh Kim*, Jeong Hoon Byeon*
Nano‑Micro Lett.(2020) 12:90
https://doi.org/10.1007/s40820‑020‑00428‑y
本文亮点

1. 设计了一种两相同轴电喷雾法制备紫杉醇负载的假血细胞微粒
2. 联合抗程序性死亡配体1抗体(Eu-FBCP/PTX+aPL)可进一步提高化疗免疫疗效
内容简介

目前,临床批准的聚合物药用树脂-聚丙烯酸树脂(Eudragit®[Eu])作为仿生纳米系统,可有效地携带抗程序性死亡配体(PD-L1)的抗体(aPL)。本研究开发了一种气-液两相电喷雾,在喷雾的机械参数和电气参数平衡的情况下,可以连续产生仅由临床相关化合物组成的仿生纳米系统[负载紫杉醇的假血细胞聚丙烯酸树脂(Eu)颗粒(Eu-FBCP/PTX)],此系统为实现临床转化的化学-免疫治疗纳米系统的发展提供了一个概念上的飞跃。Eu-FBCP/PTX纳米系统表现出吞噬和大胞饮的细胞摄取行为;在没有和存在抗PD-L1抗体的情况下,比类似大小的负载PTX的球形Eu颗粒(Eu-s/PTX)在化学-免疫治疗中具有更好的疗效。

图文导读

制备和表征

采用气泡压缩法生成Eu-FBCP/PTX的凹面结构。所设计的两相电喷雾成功地制备了凹形结构,这意味着干燥Eu溶质的气泡压制可以克服粘性力和表面张力(最好形成球形)而产生各向异性形状。用Cy5.5标记的纳米系统孵育MC-38和B16BL/6肿瘤细胞,来检测Eu-FBCP/Cy5.5和Eu-s/Cy5.5之间的细胞摄取差异。结果显示,Cy5.5标记的Eu(RL)纳米系统在MC-38和B16BL/6细胞中的细胞摄取量均显著低于Eu-FBCP/Cy5.5或Eu-s/Cy5.5的细胞摄取量。Eu-FBCP/PTX的粒径平均为320.8nm。Eu-FBCP/PTX纳米系统在48小时内的分散具有时间依赖的缓释特性(匹配HIGUCHI模型)。

图1. 空气(内喷嘴)-液体(外喷嘴;乙醇中的Eu/PTX)两相电喷雾示意图。它可以在电(BE)和机械(CaRe)参数之间的平衡下,利用Eu/PTX熔体在干燥液滴中的气泡加压产生凹面(模仿血细胞形状)颗粒(Eu FBCP/PTX),用于联合抗程序性死亡配体1(PD-L1)抗体(aPL)的化学免疫治疗。使用单相(仅适用于Eu/PTX溶液)电喷雾产生类似大小的球形颗粒(Eu-s/PTX),以便在不存在aPL的情况下进行比较。

图2. PTX不存在时Eu-FBCP和Eu-s的表征。a,b Eu-s/Cy5.5和Eu-FBCP/Cy5.5的高、低倍扫描电镜图像。通过控制乙醇溶液中Eu的浓度,在不向内喷嘴喷射空气的情况下,制备了尺寸相近的Eu-s/Cy5.5。c-f FACS结果(n=3;荧光曲线和平均荧光强度[MFI])用于比较电喷雾中添加Cy5.5后Eu-FBCP和Eu-s之间MC-38(c,d)或B16(e,f)细胞的摄取,以检查Eu-FBCP因凹形而产生更好的摄取。该分析包括Eu-RL,以确认Eu-RS和Eu-RL之间的吸收差异,为选择Eu-RS提供依据。g Eu-FBCP/PTX在PBS(嵌入数字图像)中的DLS尺寸分布和PDI。h,i Eu-FBCP/PTX的高、低倍扫描电镜(h)和透射电镜(i)图像。j Eu-FBCP/PTX在DW、PBS或RPMI+10%FBS中分散8h后的典型TEM图像研究不同介质的水动力稳定性。k在pH6.5或pH7.4(n=3)条件下,从Eu-FBCP/PTX中释放PTX 48小时。i Eu-FBCP/PTX和Eu-s/PTX以及游离PTX和Eu(RS;电喷雾前)的XRD谱图,考察并比较Eu和PTX的掺入情况。m 用不同浓度的Eu-FBCP/PTX或Eu-s/PTX(50-400μg mL-1)培养红细胞8小时后溶血结果(n=3;**p<0.01 and **p< 0.001)。

II 体外细胞活力与细胞摄取

MTT结果显示,Eu-FBCP和Eu-s(在没有PTX的情况下)均表现出高细胞活性(>95%),而游离PTX诱导剂量依赖性细胞毒性,显示出28.4μg mL-1的最大半数抑制浓度(IC50)。Eu-s/PTX,Eu-FBCP/PTX的最大半数抑制浓度分别为15.9和9.7μg mL-1,均显著低于游离的PTX。研究显示,Eu-FBCP/Cy5.5的细胞摄取较Eu-s/Cy5.5增加了3倍且Eu-FBCP/Cy5.5主要通过吞噬和大胞饮途径进入细胞。

图3. Eu-FBCP/PTX处理MC-38细胞的体外生物测定结果及可能机制。(**p<0.01 and **p<0.001)。a 用Eu-FBCP/PTX或Eu-s/PTX处理MC-38细胞24小时,以及游离PTX和单个Eu-FBCP或Eu-s(n=6)。b,c 比较Eu-FBCP/Cy5.5和Eu-s/Cy5.5细胞摄取的FACS结果(n=3;荧光谱和MFI)。d,e FACS结果(n=3;荧光谱和MFI)用于比较不同抑制剂(包括低温条件)预处理对Eu-FBCP/Cy5.5细胞摄取的影响。f 不同抑制剂预处理细胞并随后与Eu-FBCP/Cy5.5孵育的摄取途径的机制示意图。

III 细胞周期与凋亡

Eu-FBCP/PTX诱导85.4%的细胞凋亡(早期和晚期:Q2+Q3),比Eu-s/PTX诱导的细胞凋亡率高16.8%。线粒体膜电位 (ΔΨm)的丧失是Cyt c从线粒体向胞浆转运的重要标志,是凋亡程序的开始。Eu-FBCP/PTX纳米系统较其它药物组有更强的线粒体损伤效果。

图4. 不同组别的MC-38细胞的体外细胞周期和凋亡分析(1:对照,2:游离PTX,3:Eu-s/PTX,4:Eu-FBCP/PTX)。a 不同处理(1-4)的细胞周期分析结果。Brdu和PI用于计算细胞周期中每个阶段(G1、S或G2/M)的细胞分数。b,c 使用Annexin V-FITC/PI试剂盒(n=3)对24小时治疗(1-4)的凋亡情况和量化数据进行分析。d,e 处理24小时后,细胞的 FACS曲线和JC-1染色的量化数据显示(1-4)细胞(n=3)线粒体膜电位的变化。f,g p53、Bcl-2、Bax、Cyt-c、裂解caspase-9和裂解caspase-3在治疗细胞(1-4)中的代表性表达。h 基于表达(f, g)的治疗细胞(1-4)凋亡的可能机制示意图。i 处理后活/死细胞实验的代表性显微镜AO/PI染色细胞图像(1-4)。

IV 免疫原性细胞死亡诱导的免疫反应

PTX可以通过释放肿瘤抗原,如HMGB1、CRT和ATP,从死亡细胞表面诱导免疫原性细胞死亡(ICD)。HGMB1和CRT的分泌是促使树突状细胞(DCs)成熟并引发ICD的关键因素。用Eu-FBCP/PTX处理细胞后,HMGB1和CRT的表达要远远高于Eu-s/PTX组或者游离的PTX组。这些分子作为DC成熟的辅助刺激物,诱导了85.6%的成熟DC,比Eu-s/PTX(63.7%)诱导的成熟DC多21.9%,比游离PTX(42.3%)诱导的成熟DC多2倍以上。这些结果显示,Eu-FBCP/PTX处理细胞后能最大限度地提高CRT和HMGB1的表达,促进DCs的成熟和IFN-γ+CD8+T细胞的活化。

图5. 不同方法处理后,对MC-38细胞进行体外生物测定,以检测ICD诱导的的DC细胞成熟和CD8+T细胞活化。1:对照组,2:游离PTX,3:Eu-s/PTX和4:Eu-FBCP/PTX)。a 治疗组(1-4)HMGB1和CRT的代表性表达,显示ICD的诱导。b 处理细胞后(1–4)CD11c+–CD86+(作为DC成熟的指标)通过产生的TAA来识别DC的成熟。c CFSE-IFN-γ检测CD8+T细胞的增殖和活化。d 处理细胞后(1-4)活化的IFN-γ+CD8+T细胞。

体内分布

小鼠静脉注射12h内,肿瘤部位的荧光强度逐渐增加,24h后荧光强度开始降低,其中,注射Eu-FBCP/Cy5.5组的肿瘤部位荧光强度是Eu-s/Cy5.5组的1.76倍。

图6. Eu-FBCP/Cy5.5(或Eu-s/Cy5.5)的体内生物分布及不同处理(1:PBS,2:游离PTX,3:Eu-s/PTX,4:Eu-FBCP/PTX,5:aPL,6:Eu-s/PTX+aPL,7:Eu-FBCP/PTX+aPL)的抗肿瘤免疫反应。a 体内处理后,使用动物成像系统获得浓度范围为1.5625至50.0000微克/毫升的荧光Cy5.5的校准曲线。b 荧光时间影像(0、4、8、12和24小时)检测Eu-FBCP/Cy5.5和Eu-s/Cy5.5以及游离Cy5.5在静脉注射后的肿瘤蓄积情况。c 不同时间点的Cy5.5在肿瘤中的分布。d,e 静脉注射24小时后小鼠主要器官和肿瘤的典型荧光图像和量化数据。f 不同处理方法静脉注射树突状细胞瘤内成熟(1-7)(n =6; *p< 0.05,**p< 0.01, and ***p< 0.001)。g  药物处理后CD4+–CD8+T细胞浸润到肿瘤微环境中(1-7)。g,i 药物处理后肿瘤内浸润CD8+T细胞CD8+–颗粒酶B+和CD8+–IFN-γ+水平图(1-7)。

VI 体内抗肿瘤免疫治疗

为了证实Eu-FBCP/PTX纳米系统在ICD诱导的免疫治疗中的重要作用,进一步构建了相关的体内模型,以检测在aPL不存在和存在的情况下,DCs的成熟和抗肿瘤IFN-γ+CD8+T细胞的活化。实验结果显示,EuFBCP/PTX诱导的ICD可增强aPL的抗肿瘤免疫反应,诱导大量活化的CD8+T细胞对抗MC-38肿瘤。
VII 体内联合抗肿瘤作用
受Eu-FBCP/PTX与aPL联合激活抗肿瘤免疫反应的启发,对MC-38荷瘤免疫活性C57BL/6小鼠进行了联合治疗的疗效评价。在没有aPL的情况下,Eu-FBCP/PTX和Eu-s/PTX可以提高PTX的疗效并适度地抑制肿瘤的生长。而Eu-FBCP/PTX + aPL可以显著地抑制肿瘤的生长,并且给药后对小鼠的体重基本无影响,较其它实验组的小鼠的寿命更长,证实了此纳米系统较好的疗效和生物安全性。进一步的实验验证了此系统中,ICD的诱导和抗肿瘤免疫应答在治疗中的重要作用。

图7.  Eu-FBCP/PTX和Eu-s/PTX在aPL缺乏(诱导化学ICD)和存在(增强免疫抗肿瘤活性)情况下的体内抗肿瘤作用(*p< 0.05, **p<0.01, and ***p <0.001)。a 不同处理(1:PBS、2:游离PTX、3:Eu-s/PTX、4:Eu-FBCP/PTX、5:aPL、6:Eu-s/PTX+aPL和7:Eu-FBCP/PTX+aPL)体内抗肿瘤研究的实验时间表示意图。b, c从治疗小鼠(1-7;每组6只)收集的肿瘤大小和肿瘤最终重量的时间分布。d治疗小鼠的存活曲线(1-7;每组10只)。e在从治疗小鼠(1-7只,每组6只)获得的肿瘤切片中,切割的caspase-9、切割的caspase-3、CD8+和肿瘤坏死因子的组织病理学和免疫组化表达。f用PBS(正常)、IgG抗体(Iso-Ab)、CD4抗体(CD4-Ab)、CD8抗体(CD8-Ab)和CD8+CD4抗体(CD4+CD8-Ab)预处理后免疫细胞生成,构建免疫组化MC-38荷瘤小鼠模型。g, h单独用Eu-FBCP/PTX+aPL或Eu-FBCP/PTX治疗的免疫组化小鼠(每组6只)的肿瘤大小和最终肿瘤重量的时间分布。i单独用Eu-FBCP/PTX+aPL或Eu-FBCP/PTX治疗的免疫复合小鼠的存活曲线(每组10只)。

图8. 通过将Eu-FBCP/PTX与aPL结合,从Eu-FBCP/PTX诱导的ICD中促进疗效的可信模型示意图。Eu-FBCP/PTX通过吞噬和大胞饮作用进入肿瘤细胞释放PTX,诱导细胞周期G2/M期和内源性凋亡。凋亡癌细胞释放HMGB1和CRT,促进DC成熟和CD8+T细胞活化。Eu-FBCP-PTX诱导的ICD进一步促进了aPL的疗效,其仿生性能优于Eu-s/PTX。
作者简介

Jeong Hoon Byeon

助理教授

Yeungnam University

主要研究领域

气溶胶自组装“Byeon-Roberts方法”、纳米超声火焰(NSUF)合成和气相光跟踪器制造。这些技术分别用于制备生物功能纳米材料、钙钛矿基纳米复合材料和量子/荧光纳米点。

主要研究成果

发表99篇国际期刊文章,有20项申请专利和62项注册韩国专利,3项(美国)注册专利和4项(美国)+17项(PCT)申请专利。

▍Email: postjb@yu.ac.kr
▍课题组主页: 
http://postjb11.wix.com/jeonghoonbyeon

Jong Oh Kim

教授

Yeungnam Univeristy

主要研究领域

纳米药物,纳米颗粒,药物递送系统,抗肿瘤。

▍Email: jongohkim@yu.ac.kr

Jungho Hwang

Yonsei University

主要研究领域

热能工程,可再生能源技术和环境保护,能量转换,气溶胶科学与技术等。

▍Email: hwangjh@yonsei.ac.kr
▍个人主页: 
https://www.researchgate.net/profile/Jungho_Hwang/amp

撰稿:《纳微快报》编辑部

编辑:《纳微快报》编辑部

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