单分子可视化表面增强拉曼散射成像:二维Ag/BP(黑磷)纳米传感器识别肿瘤外泌体

痕量检测在环境科学、医学诊断、食品安全和病毒检测等领域具有重要意义。特别是在生物标志物的检测中,临床样本中靶标的含量通常很低,可能达到皮摩尔、飞摩尔甚至阿摩尔水平。例如,从各种组织分泌并在生物体液中循环的纳米囊泡(外泌体),它与包括癌症在内的许多疾病相关,但患者血液中的肿瘤外泌体可能是单囊泡水平,这对现有的检测方法提出了很大挑战。表面增强拉曼散射(SERS)是一种强大的检测工具,即使在单分子水平上也能检测分子的光谱信号。由于其高灵敏度和分子特异性,它被广泛应用于生化分析,如农药残留分析、病毒检测、组织肿瘤识别,甚至生物成像。然而,单分子检测仍然存在两个障碍:超灵敏SERS传感器的制备和纳米结构表面的单分子(SM)检测,即实现单分子SERS成像。近年来,二维材料因其高载流子迁移率、优异的光电活性和大比表面积而成为一种很有前景的SERS衬底。作为二维材料家族的新成员,黑磷(BP)纳米片具有出色的近红外吸收和高光热转换效率,已被用于场效应晶体管、高效光热癌症治疗和光声生物成像。同时,BP的拉曼光谱只在500 cm⁻¹以下有3个拉曼指纹峰,远离生物样品的指纹区(600-1800 cm⁻¹),完全不会干扰生物标志物的信号。因此,BP纳米片是一种理想的SERS材料。然而,现有研究表明,BP的本征SERS增强因子较弱,非常有必要通过协同电磁增强(EM)和化学增强(CM),以进一步提高BP及其杂化纳米材料的SERS灵敏度。
Visualized SERS Imaging of Single Molecule by Ag/Black Phosphorus Nanosheets

Chenglong Lin, Shunshun Liang, Yusi Peng, Li Long, Yanyan Li, Zhengren Huang, Nguyen Viet Long, Xiaoying Luo, Jianjun Liu, Zhiyuan Li, Yong Yang

Nano-Micro Letters (2022)14: 75

https://doi.org/10.1007/s40820-022-00803-x

本文亮点

1. Ag/BP-NS具备出色的表面增强拉曼散射性能和可视化单分子检测能力。这种显著的增强可归因于R6G分子共振、光诱导电荷转移共振和电磁共振的协同共振增强。

2. 本研究提出了一种新的偏振-映射方法,可以快速筛选出单分子信号,证明了得到的光谱是由单分子发射的。
3. 结合机器学习的方法可以实现对不同肿瘤外泌体的识别。
内容简介

中国科学院上海硅酸盐研究所杨勇研究员等在本研究中开发了一种通过独特的光还原将银纳米颗粒嵌入多层黑磷纳米片(Ag/BP-NS)中的特殊纳米结构来实现SM的可视化检测和成像。如图1所示,该多层结构除了存在作为EM“热点”的大量Ag纳米颗粒(约50 nm)外,许多超小的Ag纳米粒子(3-5 nm)附着在BP的表面和嵌入纳米片,从而激活了Ag-P-R6G的光诱导电荷转移(PICT)通道并带来巨大的CM增强。该基底可以在50微升10-20 mol/L的R6G溶液中检测到单个R6G分子的清晰信号,是在已报道的SERS底物中本征灵敏度最高的一种基底。此外,研究提出了一种偏振-映射方法来实现单个R6G分子的可视化SERS检测和拉曼成像。作为实际应用,利用提出的SERS方案结合机器学习方法可以识别单个肿瘤外泌体。该研究中二维Ag/BP-NS纳米传感器的制备和研究为SM的检测和SERS成像提供了可靠的策略,具有良好的生物学应用前景。

图1. Ag/BP-NS SERS传感器合成与应用示意图。

图文导读

Ag/BP-NS纳米片表征

如图2所示,在这项工作中合成的复合纳米片与已报道的Ag/BP-NS复合材料有显著不同。除了表面上的大银纳米粒子外,BP纳米片的表面和插层之间还分布着许多超小的银纳米粒子。大多数银纳米颗粒(50-100 nm)很好地附着在BP纳米片上(图2a)。随后,将Ag/BP-NS悬浮液稀释并剥离纳米片以暴露纳米片内层。如高角度环形暗场(HAADF)图像(图2c)所示,可以观察到大量直径约3-5 nm均匀分布的超小Ag纳米颗粒紧密附着在表面或嵌入BP纳米片。然而,在没有光照的情况下合成的Ag/BP-NS样品中几乎没有观察到小尺寸的银纳米颗粒(图2d)。这是由于BP纳米片在光激发下可以产生大量的光生电子,使得Ag纳米粒子的成核速度迅速提高,从而提高了溶液中Ag纳米粒子的还原效率。此时一些成核纳米粒子在溶液中Ag⁺耗尽之前将无法生长,因此超小的Ag纳米粒子原位沉积在纳米片的表面和插层。

图2
为了研究Ag-BP的结合状态,用X射线光电子能谱(XPS)分析了Ag/BP-NS中元素的表面组成和价态。图3a显示了130.1、130.9和134.5 eV三个峰,分别属于样品的P 2p3/2、P 2p1/2和微量的氧化磷(PxOy)。值得注意的是,与不含银纳米颗粒的黑磷相比,负载银纳米颗粒的BP纳米片中氧化磷的峰值比例显著增加(图3b),这表明黑磷在银纳米颗粒的原位还原中起到还原剂的作用。然而,与其他文献报道的BP和贵金属复合材料的XPS结果相比,本研究制备的复合材料的P 2p峰清晰而尖锐。同时,氧化磷峰的峰比明显低于p2p,表明纳米片在合成和储存过程中得到了很好的保护,保留了其独特的二维结构,避免了过度氧化。此外,Ag/BP-NS的XPS光谱在129.4 eV处显示出一个子带,这归因于Ag-P的键合。在图3c中,368.5 eV和374.5 eV的带分别属于Ag 3d5/2和Ag 3d3/2。与纯BP和纯Ag相比,在Ag/BP-NS的情况下,P 2p3/2 (130.2 eV)、P 2p1/2 (131.0 eV)的结合能存在0.1 eV的正位移,而Ag 3d的存在0.3 eV的位移,这可能是由于Ag和P原子之间的电荷转移所致。高斯计算结果也支持Ag/BP-NS衬底上Ag原子和BP原子之间存在明显的电荷转移。
图3

II Ag/BP-NS纳米片上的单分子检测

未经Ag修饰的BP纳米片对R6G的最低检测限(LOD)可以达到10⁻⁸ M,无光照的情况下制备的Ag/BP-NS纳米片上R6G的LOD仅为10⁻⁹ M,这与相关文献中报道的结果相似。而通过光还原制备的Ag/BP-NS显示出极高的SERS灵敏度,LOD为10⁻²⁰ M (图4a),是所有报道的SERS基底中灵敏度最高的之一,可以达到单分子的水平。同时,计算的最大增强因子(EF)在1507 cm⁻¹处为0.101×10¹²,对应于芳香环的C-C拉伸(图4b)。

为了验证Ag/BP-NS的单分子检测能力,进行了以下验证。一般来说,如果探针分子的浓度小于10⁻¹¹ M,在不考虑基底对探针分子富集的情况下,显微拉曼测量区域(激光聚焦区)中可检测分子数仅有单个分子或几个分子。如图4a所示,这里收集了从10⁻⁸到10⁻²⁰ M的一系列浓度梯度的R6G分子的拉曼信号。需要注意的是,由于R6G分子的极化特性,在低浓度下R6G的指纹峰不会全部出现,只有分子极化方向与偏振光方向相同的振动才会被增强。图4c-e给出了不同浓度(10⁻¹⁸-10⁻²⁰ M) R6G在Ag/BP-NS基底上的拉曼映射(Mapping)图像和SERS成像结果。

图4

在如此低的浓度下,可以排除分子聚集的干扰,所以可以认为真正得到了单分子的信号。随后,计算了Ag/BP-NS基板上R6G在1360 cm⁻¹处的特征峰强度。如图5a所示,拉曼信号在10⁻⁷到10⁻¹⁰ M范围保持很好的内线性关系,相关系数为0.94001。然而,当浓度低于10⁻¹¹ M时,获得的探测信号不再与之前的数据线性相关。并且数据之间的强度波动变化不大,说明在出现信号的区域处只有一个或几个R6G分子。然后,这里提出了一种偏振-映射方法来分析从超低浓度溶液中获得的R6G信号是否由单分子发射。图5b给出了偏振-映射策略的示意图。R6G分子是不对称的,所以分子具有极性。因此,其拉曼光谱具有偏振特性。如果拉曼光谱不是单分子发射的,而是大量分子吸附在基板上并随机分布。那么采集到的分子信号在各个方向的极化张量是具有平均效应的统计结果。因此,当在光路中添加偏振片时,偏振光谱之间只会存在强度差异。相反,对于单分子偏振光谱,与偏振光方向不同的极化方向就不会被增强,所以光谱的差异不仅会表现在强度上,还会导致一些峰的消失和相对强度的变化。因此,可以通过研究R6G分子的偏振拉曼光谱来判断信号是否是单分子发出的。

在这里,分别在激光器后方和信号收集器之前各放置一个偏振片,随后通过mapping在10⁻¹⁵ M R6G样本中扫描60×60 μm²的矩形区域并分析其中的清晰信号。通过转动信号收集器前面的偏光片,使其与激光器后面的偏光片平行或垂直, R6G的平行和垂直偏振光谱均在同一点采集。如图5c所示,将信号采集器前的偏振片旋转90°后,部分指纹峰明显消失,平行偏振光谱与垂直偏振光谱的特征峰的相对强度也发生了变化。这是由于偏光片滤掉了单分子在其他方向上的散射光子,该实验给出了单分子存在的重要证据。基于上述原理和实验结果,我们提出了一种结合映射和偏振光谱来表征单分子的方法。如图5d-f所示,在这里,我们采用1648 cm⁻¹的拉曼强度进行映射成像。当没有在光路中添加偏振片时,获得了16个清晰的分子信号(图5d)。在光路中加入偏振器后,指纹峰的变化反映在垂直偏振映射光谱中,部分信号消失(图5e)。继续旋转偏振片,如图5f所示,原本在垂直映射中出现的一些清晰信号也消失了。但无论是平行偏振光谱还是垂直偏振光谱,信号的位置都可以与未放置偏振片的光谱一一对应。上述现象表明,可以实现基于Ag/BP-NS的单分子可视化检测和表征。

图5
III SERS增强机制

如图6a所示,分别通过(1)光还原法和(2)普通方法合成了Ag/BP-NS的悬浊液,以及通过(3)化学还原法合成了Ag的悬浊液。通过不同方法合成的Ag纳米颗粒的尺寸相似(图6b-e)。然而,通过光还原合成的杂化纳米片的悬浊液外观更接近银胶体,既产生了更多的银纳米颗粒,这也由SEM图像所证实(图6b、d)。正如上面提到的,BP纳米片在激发光下可以产生大量的光生电子,以提高Ag纳米粒子的还原效率。因此,光还原方式带来了像化学还原一样更高的还原效率,必然会带来更多的“热点”。

图6

如图7a-c所示,通过有限差分时域(FDTD)模拟了BP纳米片和Ag/BP-NS纳米片的电磁场分布情况。BP的局部等离子体共振可以被532 nm入射光激发(图7a)。随后,计算了吸附在BP上的二聚体(Ag纳米颗粒)。如图7b所示,直径为50 nm 的Ag颗粒提供了明显的电磁增强。强耦合共振主要分布在二聚体(Ag纳米粒子)的“间隙”和BP表面。根据SERS增强因子与局域电场增强因子的对应关系,电磁可以提供大约10⁸的增强。

图7

虽然直径为5 nm的Ag纳米粒子没有提供明显的电磁增强(图7c),但BP/Ag异质结构中高效的载流子迁移率可以有效地促进化学增强过程和光活性。如图8a所示,通过Gaussian计算的R6G光谱表明Ag4-P6簇中存在明显的化学增强。更重要的是,Ag4-P6-R6G簇的计算带隙(图8b)更接近532 nm激光下的“带隙共振”(2.33 eV)。

图8

除了EM和CM的计算结果,下面又通过实验进一步证明了该体系存在显著的电荷转移。如图9a所示,Ag纳米颗粒(约50 nm)由于等离子体共振和R6G在532 nm处的光吸收之间的耦合,可以强烈增强分子的拉曼信号。Ag纳米粒子的光吸收在532 nm后逐渐下降(图8c)。所以推测,在633和785 nm波长下增强效果会逐渐减弱。如图9b所示,实验结果确实与预测结果一致。虽然Ag/BP-NS 的光吸收在785 nm处迅速下降,但在633 nm处并未下降。然而,在改变激发波长后,基底的增强作用迅速消失(图9c、d),这不符合EM定律。因此,在Ag/BP-NS中必然存在“带隙共振”的化学增强。与未光照制备的纳米片相比,光还原(hv)制备的Ag/BP-NS在633 nm激发光下仍保持一定的增强,这也证实了光还原可以给纳米片带来更多的“热点”。此外,光还原基底的光吸收强度也显着高于其他基底。总之,通过光还原制备的Ag/BP-NS具有三各方面的协同共振,包括Ag纳米粒子周围的电磁共振(约50 nm)、光诱导电荷转移共振(Ag-P-R6G簇)和分子共振。

图9

IV 基于Ag/BP-NS的肿瘤外泌体检测

外泌体来源于细胞内溶酶体颗粒内陷形成的微囊泡。它们携带反映细胞特征的核酸、蛋白质、脂质和代谢物的化学信息。因此,许多研究使用外泌体作为肿瘤诊断和预后的生物标志物。然而,包括蛋白质印迹或酶联免疫吸附试验(ELISA)在内的传统检测方法需要复杂的程序或大量样本进行检测。鉴于这些繁琐的操作或有限的准确性限制,传统的外泌体分析方法在临床诊断中存在许多障碍。所以SERS可能是一种理想的检测方法,因为它具有快速和高灵敏的检测特点。这里选择了A549(肺癌)和HCT-116(结肠癌)两种来源的外泌体测试Ag/BP-NS对肿瘤外泌体的识别能力,检测限可以达到5×10⁷ particles/mL(人体血液外泌体浓度约为10⁹ particles/mL),即单囊泡水平。

最后利用机器学习的方法进行光谱识别,研究中选择了两种外泌体和PBS干扰各自100个光谱进行训练和测试。随机选择300个光谱中的60%作为训练集,其余光谱作为测试集。如图10a、b所示,经过训练的模型在预测训练集和测试集时的灵敏度值分别为100%和99.17%。事实上,测试集中只出现了1例误判,这表明Ag/BP-NS结合机器学习方法具有在单囊泡水平上区分肿瘤外泌体的能力。

图10

结论:研究通过光还原方法合成了一种独特的Ag/BP-NS纳米片。Ag/BP-NS表现出惊人的本征SERS灵敏度,EF为0.101×10¹²,LOD可以达到单分子水平。检测过程无需任何物理富集,即可在10⁻²⁰ M R6G 溶液中获得清晰的单分子信号。Ag/BP-NS基底优异的SERS增强能力来自于电磁共振、光诱导电荷转移共振和R6G分子共振的协同共振增强。此外,我们通过提出的偏振-映射光谱,实现了单个R6G分子在Ag/BP-NS上的精确定位和SERS成像。该基底在实际应用中也具有优异的性能,具有良好的生物相容性和均匀性。结合SERS成像和机器学习,可以区分和识别不同细胞系中的肿瘤外泌体。所制备的二维Ag/BP-NS具有单分子/囊泡检测能力,结合其在肿瘤治疗领域的优异性能,有望建立独特的肿瘤检测和治疗体系。

作者简介

杨勇

本文通讯作者

中国科学院上海硅酸盐研究所 研究员

主要研究领域

(1) 用于能源和环境的纳米光电材料与纳米生物传感器件;(2) 激光与物质表界面光学作用,陶瓷表面改性及光学薄膜;(3) 陶瓷增材制造科学与空间应用。

个人简介

中国科学院上海硅酸盐研究所研究员,博士生导师,中国科学院杰出人才计划和上海市浦江人才计划。多年来主要从事纳米生物传感材料、增材制造空间光学陶瓷的基础和应用研究。作为首席科学家承担国家重点研发计划重点专项、国家重点研发国际合作、国家自然科学基金及高技术类项目20多项,累计科研经费超7000余万元。在材料类顶级学术期刊Matter、Advanced Science、Nano Energy、Nano-Micro Letters及Additive Manufacturing等发表第一/通讯SCI论文130篇,多篇ESI高被引。获得中国及日本授权发明专利15项,英文书章节3篇。以分会主席在国际航天会议、亚太陶瓷玻璃大会、中国纳米年会等做邀请报告30余次。

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Nano-Micro Letters《纳微快报(英文)》是上海交通大学主办、Springer Nature合作开放获取(open-access)出版的学术期刊,主要报道纳米/微米尺度相关的高水平文章(research article, review, communication, perspective, etc),包括微纳米材料与结构的合成表征与性能及其在能源、催化、环境、传感、电磁波吸收与屏蔽、生物医学等领域的应用研究。已被SCI、EI、PubMed、SCOPUS等数据库收录,2020JCR影响因子达16.419,学科排名Q1区前10%,中科院期刊分区1区TOP期刊。多次荣获“中国最具国际影响力学术期刊”、“中国高校杰出科技期刊”、“上海市精品科技期刊”等荣誉,2021年荣获“中国出版政府奖期刊奖提名奖”。欢迎关注和投稿。
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